23888

BIO3 199

دكتري

بيوشيمي

علوم و فناوري‌‌‌هاي زيستي

1403/05/20

106 ص.

رحمان امام زاده

محبوبه نظري

سرطان كبد , آلفافتوپروتئين , نانوبادى , نانولوسيفراز جداشده , لومينسانس

سرطان كبد يكي از شايعترين سرطان ها و جزء 10 علت اول مرگ در اثر سرطان، در جهان است. پيشآگاهي، تشخيص و درمان سرطان كبد به شناسايي زيستنشانگر آلفافتوپروتئين وابسته است. جديدترين لوسيفراز مهندسي شده به نام نانولوسيفراز به دليل اندازه كوچك، تابش فراوان و پايدارى ساختارى، نسبت به ساير لوسيفرازها بيشتر موردتوجه قرار گرفته كه اخيرا شكل تقسيم شده آن منجر به افزايش بيشتر كارايي و زمينهساز طراحي سيستمهاى پيچيدهتر و مدرن شده است. نانوبادىها، قطعات آنتيبادى هستند كه از آنتي بادىهاى تنها با زنجيره سنگين در خانواده شتر سانان به دست ميآيند. به دليل اندازه كوچك، ساختار ساده، تمايل باال در اتصال به آنتيژن و پايدارى فوقالعاده در شرايط سخت، نانوبادىها اين قابليت را دارند كه بر برخي محدوديتهاى آنتيبادىهاى مونوكلونال مرسوم غلبه كنند. اين مطالعه باهدف ابداع يك روش جديد براى شناساييآلفافتوپروتئينبا استفاده از سيستم نانولوسيفراز سه قطعهاى و نانوبادىهاى شناساييكنندهآلفافتوپروتئين انجام شده است. اين استراتژى شامل اتصال نانوبادىهاى ضد آلفافتوپروتئين به نامهاى 5P و 18P به ترتيب با پپتيدهاى نانولوسيفراز سه قطعهاى 9βو 10β ميباشد. بعد از شناسايي آلفافتوپروتئين از طريق نانوبادى ها، در حضور سومين جزء نانولوسيفراز به نام S11Δ، با قرارگيرى اجزاء نانولوسيفراز سه قطعهاى در مجاورت هم بازآرايي ساختار اين آنزيم شكلگرفته و باعث فعالشدن لوسيفراز و انتشار لومينسنت ميشود. پس از بيان و خالصسازى اجزاء سيستم، اين زيستحسگر محدوده شناسايي خطي 1 تا 20 نانوگرم در ميليليتر آلفافتوپروتئين را با حد تشخيص 0/5 نانوگرم در ميليليتر نشان ميدهد. همچنين نتايج به دستآمده با سنجش االيزا مطابقت داشت كه نشان دهنده كارايي اين سيستم جديد است. اين دستاورد جديد با استفاده از نانوبادىها در شناسايي آلفافتوپروتئين يك زيستحسگر همگن با كاربرى آسان را ارائه ميدهد.

Liver cancer , Alpha-fetoprotein , Nanobody , Split-nanoluciferase , Luminescent

Nanobody-based immunoassay design to measure alpha-Fetoprotein as a liver tumor biomarker in human

زيست شناسي سلولي مولكولي و ميكروبيولوژي

Liver cancer is one of the most common cancers and is among the top 10 leading causes of cancer deaths worldwide. The prognosis, diagnosis, and treatment of liver cancer depend on the identification of the alpha-fetoprotein (AFP) biomarker. The newest engineered luciferase, called nanoluciferase, has garnered more attention than other luciferases due to its small size, abundant emission, and structural stability. Its split form has recently increased capability and paved the way for designing more modern and complex systems. Nanobodies are antibody fragments derived from heavy-chain-only antibodies found in camelids. Due to their small size, simple structure, high affinity for antigen binding, and exceptional stability under harsh conditions, nanobodies have the potential to overcome some limitations of conventional monoclonal antibodies. This study aimed to pioneer a novel method for AFP detection using a three-part split nanoluciferase system and nanobodies targeting AFP. This strategy involves fusing anti-AFP nanobodies, named P5 and P15, with the three-part nanoluciferase peptides β9 and β10, respectively. After AFP detection by nanobodies, in the presence of the third nanoluciferase component Δ11S, the proximity-induced reassembly of the three-part nanoluciferase structure occurs, activating luciferase and emitting luminescence. Following the expression and purification of the system components, this biosensor demonstrated a linear detection range of 1 to 20 ng/ml of AFP with a limit of detection (LOD) of 0.5 ng/ml. Additionally, the results matched those obtained from the ELISA test, indicating the efficiency of this new system. This innovative achievement using nanobodies for AFP detection offers a homogeneous and userfriendly biosensor.

4