23801

BIO3 196

دكتري

بيوشيمي

علوم

1403/06/26

439412 ص.

محمدرضا گنجعلي خاني

مزدك گنجعلي‌خاني حاكمي

سرطان , نقاط بازرسي ايمني , ايمونوتراپي , PD-1 , PD-L1 , بهينه‌سازي ميل اتصال , طراحي از نو , آنتي‌بادي , پروتئين‌هاي متصل شوندۀ كوچك , مناطق كليدي

كنترل و درمان سرطان براي بهبود كيفيت زندگي در انسان بسيار مهم است. پيشرفت‌هاي اخير در درمان‌هاي مبتني بر مهاركننده‌هاي نقاط بازرسي به عنوان يك استراتژي درماني جديد و اميدواركننده براي توسعۀ داروهاي ضد سرطان معرفي شده‌اند. بسياري از انواع سرطان از مسير PD-1/PD-L1 استفاده مي‌كنند كه با غيرفعال كردن سلول‌هاي T مرتبط است. در سال‌هاي اخير، آنتي‌بادي‌هاي مونوكلونال (mAbs) براي مهار نقاط بازرسي ايمني مورد استفاده قرار گرفته‌اند كه اين امر موجب عادي‌سازي پاسخ ضد تومور شد. طراحي از نو پروتئين يك زمينه در حال ظهور براي توليد مولكول‌هاي دارويي مبتني بر پروتئين با استفاده از روش‌هاي محاسباتي است. در موارد متعدد، بهبود ميل اتصال آنتي بادي‌هاي موجود براي آنتي‌ژن‌ها اغلب گزينۀ بهتري است. در مرحلۀ اول مطالعه، از روش‌هاي in silico براي شناسايي جايگاه‌هاي اتصال بر روي سطح PD-1 و PD-L1 و بهينه‌سازي انواع mAb در مقياس بزرگ استفاده شد. ابتدا، با استفاده از پروتكل RosettaDesign هزاران آنتي‌بادي براي 11 جايگاه متفاوت بر روي PD-1 و PD-L1 طراحي شد و طراحي‌هايي با پايداري، ميل اتصال و شكل مكمل بالاتر انتخاب شدند. نتايج بدست آمده نشان مي‌دهد كه جايگاه‌هاي اتصال 1، 3 و 6 بر روي PD-1 و جايگاه‌هاي اتصال 9 و 11 بر روي PD-L1 را مي‌توان به عنوان مناسب‌ترين جايگاه‌ها براي مهار ميانكنش PD-1-PD-L1 توسط آنتي‌بادي‌هاي طراحي‌شده در نظر گرفت. همچنين نشان داده شد جهش‌ها در نواحي CDRها الگوي ميانكنش بين آنتي‌بادي‌هاي طراحي‌شده و اهداف (PD-1 و PD-L1) را با بهبود ميل اتصال براي مهار مؤثر ميانكنش پروتئين-پروتئين و مهار نقاط بازرسي ايمني، بازآرايي مي‌كنند. در مرحلۀ دوم، با استفاده از پروتكل RAbD، هزاران آنتي‌بادي از نو طراحي شد. 8/23 و 38/15 درصد آنتي‌بادي‌هايي با ميل اتصال بالا به ترتيب براي جايگاه‌هاي اتصال 1 و 5 به دست آمد. ميزان موفقيت طراحي CDRهاي غير H3 1-7/3 و 1.42-5.63 به ترتيب براي جايگاه اتصال 1 و 5 به دست آمد. تجزيه و تحليل از تغييرات صورت‌بندي هر CDR پس از اتصال نشان داد HCDR3 بالاترين تحرك را دارد. همچنين مشاهده شد كه گليكان N58 گيرندۀ PD-1 در شناسايي و اتصال به mAb059c و طراحي‌هاي جايگاه اتصال 5 نقش دارد كه باعث افزايش تقريباً دو برابري ميل اتصال مي‌شود. در مرحلۀ سوم، پروتئين‌هاي متصل شونده كوچك با توپولوژي‌هاي مختلف، طراحي و بهينه سازي شدند و 20 طراحي پايدار با ميل اتصال بالا شناسايي و انتخاب گرديد. مقادير ROC براي جايگاه‌هاي اتصال 1 و 2 به ترتيب 83/0و 79/0 به دست آمد كه نشان مي‌دهد رتبه بندي نسبي طراحي‌ها به طور كلي دقيق است. نتايج نشان داد ميزان موفقيت كلي روش‌هاي محاسباتي از قبيل RosettaDesign و RAbD در طراحي پروتئين‌ها پايين است. با اين حال، پروتئين‌هاي متصل شوندۀ كوچك طراحي شده به طور انتخابي و كارآمد به گيرنده PD-1 با ميزان موفقيت 65٪ متصل مي‌شوند. اين مطالعه اطلاعات جامعي را در مورد اپي‌توپ‌هاي اتصال بر روي PD-1 ارائه مي‌كند كه مي‌تواند به عنوان مناطق كليدي براي طراحي داروهاي زيستي در نظر گرفته شود.

Cancer , Immune checkpoints , Immunotherapy , PD-1 , PD-L1 , Binding affinity optimization , De Novo design , Antibody , Mini-protein binder , binding hotspot

Computational de novo design of mini-protein binder and antibody for immune checkpoints involved in cancer and comparing performance and affinity of the designed models

زيست شناسي

Cancer control and treatment are crucial for improving the quality of life in humans. Recent advancements in checkpoint inhibitor-based therapies have emerged as a promising novel treatment strategy for developing anti-cancer drugs. Many cancer types utilize the PD-1/PD-L1 pathway, which is associated with deactivation of T cells. In recent years, monoclonal antibodies (mAbs) have been utilized to block immune checkpoints, thereby enabling the normalization of the anti-tumor responses. De novo protein design using computational methods is an emerging area in the production of protein-based drug molecules. In numerous situations, improving the affinity for antigens is often the most attractive option. In the initial phase of the study, we used the in silico methods to identify binding sites on the PD-1 and PD-L1 and to optimize mAb variants on a large scale. First, using the RosettaDesign protocol, thousands of antibodies have been generated for 11 different regions on PD-1 and PD-L1 and then the designs with higher stability, affinity, and shape complementarity were selected. The results suggest that binding sites 1, 3 and 6 on PD-1 and binding sites 9 and 11 on PD-L1 can be regarded as the most appropriate sites for the inhibition of PD-1-PD-L1 interaction by the designed antibodies. The results also showed that mutations in the CDRs regions will rearrange the interaction pattern between the designed antibodies and targets (PD-1 and PD-L1) with improved affinity to effectively inhibit protein-protein interaction and block the immune checkpoint. In the second phase, thousands of de novo designed antibodies have been generated using the RAbD protocol. 23.8% and 15.38% high-affinity antibodies for binding sites 1 and 5 have been obtained, respectively. The success rate of design non-H3 CDRs of 1-3.7 and 1.42-5.63 for binding site 1 and 5, respectively. The analysis of the conformational changes in each CDR upon binding revealed that HCDR3 showed highest movement. It is showed that N58 glycan of PD-1 plays a critical role in recognition and binding to mAb059c and de novo designs of binding site 5 with an affinity that is approximately two-fold stronger than expected. In the third phase, mini-protein binders with diverse topologies designed and then optimized, and identified 20 designs with exceptional stability and affinity. The obtained ROC values of 0.83 and 0.79 for binding sites 1 and 2 indicated that the relative ranking of the designs is generally accurate. The outcomes of the study show that the general success rate of computational methods such as RosettaDesign and RAbD in design proteins is low. However, mini-protein binders designed selectively and potently bind to the PD-1 receptor with a success rate of 65%. This study provides comprehensive information regarding the binding epitopes on PD-1 which could be considered as hotspots for designing potential biopharmaceuticals.

4