23664

BIO2 1020

كارشناسي ارشد

بيوشيمي

علوم و فناوري‌‌‌هاي زيستي

1403/04/11

84

فاطمه جوادي زرنقي

دنازيم ، هپاتيت ب ، سوبستراي جهش دار ، برش، اثرات خارج از هدف

نگاه به نوكلئيك اسيد تنها به عنوان ماده ژنتيكي به دوصورت DNA و RNAتا اوايل دهه 1980 ميلادي با كشف RNA وDNAهاي كاتاليتيك تغيير كرد. آنزيم هاي از جنس اسيد نوكلئيك را مي توان به رايبوزيم ها ؛ دئوكسي رايبوزيم ها يا دنازيم(DNAzyme) و پليمرهاي ژنتيكي تقسيم بندي كرد.دئوكسي رايبوزيم ها بر اساس واكنشي كه بر سوببستراي نوكلئوتيدي انجام مي دهند را ميتوان به برش DNA؛ برش RNA ؛ اتصال RNA و اتصال DNA تقسيم بندي كرد.موضوع مهم در استفاده از اين آنزيم ها علي الخصوص دنازيم هاي برش دهنده؛ طراحي درست و دقيق آن ها و ايجاد شرايط محيطي درست براي عمكرد بهينه آن هاست.لازم بذكر است كه اين آنزيم ها براي عملكرد خود و گرفتن ساختار كاتاليتيك ؛ به شرايطي از جمله pH محيطي خاص ؛ غلظتي مشخص از يونهاي فلزي مثل Mn2+ و... نياز دارند .آنزيم هاي اسيد نوكلئيكي چه رايبوزيم ها و چه دنازيم ها داراي دو قلمرو مختلف يكي با فعاليت آنزيمي (هسته ي كاتاليتيك) و ديگري براي شناسايي سوبستراي (قلمروهاي متصل شونده به سوبسترا) هستند. به دليل تشابه نوكلئوتيدي در توالي هدف،گاهي اوقات اين امكان وجود دارد كه دنازيم علاوه بر برش در سوبستراي خاص در سوبستراي مشابه ديگر برش ايجاد كند كه آن را مسئله Off-target issue مي نامند ؛ به طور دقيق تر مي توان گفت كه يك دنازيم مي تواند علاوه بر شناسايي توالي جايگاه تشخيص ويژه خود در يك توالي خاص و ايجاد برش در آن در جايگاه هاي غير اختصاصي مشابه نيز برش ايجاد كند.از اين رو واكاوي و تحليل اين مسئله در ابتدا براي بهبود اثربخشي و سپس كارايي دنازيم ها ضروري است. از اين رو براي بررسي اين مسئله يك دنازيم با نام 6YR25 كه در حضور كوفاكتور هاي Mn2+ و Zn2+ ساختار كاتاليتيك به خود مي گيرد انتخاب شد. سوبستراي اين آنزيم از قسمتي از توالي ويروس هپاتيت B با توجه به ويژگي هاي خاص ژنومي اين ويروس است كه آن را براي ايجاد برش در DNA تك رشته توسط دنازيم مستعد مي كند ؛ استفاده شد. از ژنوم ويروسي سنتز شده در فرم هاي بدون جهش و جهش دار نقطه اي و بررسي رفتار دنازيم در مواجه با اين سوبسترا ها در شرايط آزمايشگاهي استفاده شدو در هرحالت Ymax و kobs واكنش براي بررسي اثر جهش در سوبسترا بر فعاليت دنازيم محاسبه شد.

DNAzyme, Hepatitis B Virus, Mutant Substrate, Cleavage, Off target issue

Investigating the activity of 6YR25 on point-mutant substrates; designed and synthetized from Hepatitis B virus genomic sequences

زيست شناسي سلولي مولكولي و ميكروبيولوژي

The perspective of nucleic acids solely as genetic material in the forms of DNA and RNA changed in the early 1980s with the discovery of catalytic RNAs by Thomas Cech and Sidney Altman, and catalytic DNAs in 1994 by Breaker and Joyce. Nucleic acid enzymes can be classified into ribozymes, deoxyribozymes (or DNAzymes), and genetic polymers. Deoxyribozymes can be categorized based on the reactions they perform on nucleotide substrates, including DNA cleavage, RNA cleavage, RNA ligation, and DNA ligation.It is important to note that these enzymes require specific conditions such as particular environmental pH and specific concentrations of metal ions like Mn2+ for their catalytic structure. Both ribozymes and DNAzymes possess two different domains: one for enzymatic activity (the catalytic core) and another for substrate recognition (substrate-binding domains). Due to nucleotide similarity in the target sequence, there is sometimes a possibility that a DNAzyme might cleave a similar, non-specific substrate, known as the off-target issue. Specifically, a DNAzyme can recognize and cleave not only its designated specific sequence but also similar non-specific sites. Therefore, investigating and analyzing this issue is essential to improve, first, the effectiveness and then the efficiency of DNAzymes.To examine this issue, a DNAzyme named 6YR25, which adopts a catalytic structure in the presence of Mn2+ and Zn2+ cofactors, was selected. The substrate for this enzyme was chosen based on a part of the Hepatitis B virus genome, given the specific genomic characteristics of this virus that make it susceptible to single-stranded DNA cleavage by DNAzymes. Synthesized viral genomes in both non-mutated and point-mutated forms were used, and the DNAzymeʹs behavior in response to these substrates was analyzed under laboratory conditions. In each case, the Ymax and kobs of the reaction were calculated to assess the effect of substrate mutation on DNAzyme activity.

4

33501